▌蛋白表达概念与体系分类

蛋白表达是指在特定宿主细胞中实现外源基因转录与翻译的过程，是现代分子生物学与蛋白工程的重要实验手段。

根据宿主类型的不同，表达体系通常分为两大类：原核表达系统与真核表达系统。

前者以大肠杆菌为代表，特点是生长迅速、操作简便、成本低；后者如哺乳动物细胞或酵母系统，更适合具有复杂修饰的蛋白。

原核体系因成熟度高、效率快、适应范围广，至今仍是研究人员进行重组蛋白表达的首选平台。

▌原核蛋白表达的基本过程

在大肠杆菌中实现外源基因的表达，通常经历以下关键步骤：

● 载体构建：将目标基因插入合适的表达载体，载体需具备启动子、终止子、抗性标记及复制起点等元件。

● 转化宿主：通过热激或电穿孔等方式将重组质粒导入感受态大肠杆菌细胞内。

● 诱导表达：在细胞生长至对数期后加入诱导剂（如 IPTG），启动目标基因的转录与翻译。

● 产物收集与分析：通过离心收集菌体，提取蛋白后进行电泳或功能验证。

这四步构成了原核蛋白表达系统的核心框架，实验思路清晰，便于优化与规模化放大。

▌启动子与IPTG诱导机制

原核系统的调控核心在于启动子与操纵子结构。以大肠杆菌常用的 lac 操纵子 为例，其转录依赖乳糖或其类似物的诱导作用。在无诱导剂存在时，LacI 阻遏蛋白结合在操纵序列上，阻止 RNA 聚合酶启动转录；加入 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） 后，IPTG 与 LacI 结合，使其构象发生变化并脱离 DNA；此时，RNA 聚合酶能够结合启动子区，从而开启目标基因的转录。这种人工可控的诱导方式使研究人员能够精确掌握表达时机与强度，避免毒性蛋白的过早积累。

▌载体构建与宿主选择

一个成熟的原核表达载体通常包括：

● 强启动子（如 T7、Tac、Lac、PL/PR 等）；

● 核糖体结合位点（SD 序列）；

● 多克隆位点（MCS）；

● 筛选标记基因（如氨苄青霉素或卡那霉素抗性）；

● 融合标签（如 His、GST、MBP、SUMO 等）。

宿主菌株的选择则需结合目标蛋白特性。例如：

通过合理搭配载体与宿主，可以显著提升蛋白生产效率与可溶性。

▌可溶性与包涵体问题

原核体系中，高水平表达常导致蛋白在胞内形成包涵体，呈现不溶性聚集状态。这虽然提高了总产量，却降低了功能性。

提升可溶性表达的常见策略包括：

● 降低诱导温度与 IPTG 浓度；

● 使用融合标签（GST、MBP、NusA 等）；

● 与伴侣蛋白（GroEL/GroES、DnaK/DnaJ）共表达；

● 采用弱启动子或冷激载体（如 pCold）；

● 通过分泌型表达将蛋白导向胞外或周质空间。

必要时，也可对包涵体进行变性复性处理，使蛋白重新折叠为天然构象。

▌不同原核系统的应用差异

原核蛋白表达体系在设计上并非单一形式。以下是几种常见系统的比较：

不同体系在研究与产业化阶段各有适用场景，选择时需根据蛋白特征与实验目标综合考虑。

▌真核基因在原核系统中的挑战

将真核来源的基因放入原核体系表达时，往往遇到以下问题：

● 基因中含内含子，无法在原核中正确剪接；

● 缺乏真核修饰系统（糖基化、磷酸化等）；

● 密码子偏好性差异导致翻译停顿；

● 蛋白中信号肽或跨膜结构影响折叠；

● 某些外源蛋白对宿主具有毒性。

这些问题可通过使用 cDNA、密码子优化、稀有 tRNA 补充、信号肽删除等手段得到部分解决。

▌系统优化与实验思考

表达系统优化是获得高质量蛋白的关键环节。

研究人员常通过以下方式改进实验条件：

● 设计梯度诱导实验（温度、浓度、时间）；

● 比较不同培养基配方（LB、TB、2×YT 等）；

● 测试不同融合标签或宿主菌株；

● 在小试条件下验证可溶性与活性。

● 通过多维度的参数调控，可以在效率与正确折叠之间取得平衡，使原核蛋白表达在科研与应用开发中更具可控性。

▌总结

原核表达体系以其高效、成熟和可扩展性，长期作为蛋白质研究的基础平台。尽管其在翻译后修饰方面存在限制，但凭借快速表达与低成本优势，仍是结构解析、功能验证与工艺开发中不可替代的技术工具。随着载体构建、宿主改良及复性技术的不断进步，原核系统的能力正被进一步拓展，在未来的蛋白质表达服务与蛋白生产领域中将持续发挥重要作用。