在生命科学研究与生物技术开发领域，高纯度、高活性的天然蛋白是揭示生命机理、进行分子互作研究和开发新型生物工具的基石。与重组表达系统生产的蛋白相比，天然蛋白直接来源于其原始生物组织或细胞，保留了其天然的翻译后修饰、正确的折叠构象以及完整的功能复合体形式，这对于许多依赖于特定糖基化、磷酸化或天然构象的研究至关重要。

▌天然蛋白的来源与重要性

天然蛋白，或称内源性蛋白，是指直接从动物、植物、微生物的组织、器官或体液中分离纯化得到的蛋白质。这些蛋白未经异源宿主系统的重组表达，因此其氨基酸序列、空间结构及各种翻译后修饰（PTMs）均与原始生物体内状态高度一致。例如，从哺乳动物脑组织中纯化的天然膜蛋白，其脂质环境、糖基化模式对维持离子通道功能不可或缺；从血清中分离的多种细胞因子与生长因子，其天然存在的复合物形式及活性状态，是细胞信号通路研究的黄金标准。许多酶活性研究、抗体生产中的免疫原制备、以及蛋白质相互作用验证实验，都要求使用天然来源的蛋白作为关键试剂，以确保实验结果的生理相关性和可靠性。

▌天然蛋白纯化的核心技术流程概述

天然蛋白的纯化是一项系统工程，其目标是从含有成千上万种不同蛋白的复杂混合物中，特异性地分离出目标蛋白，并最大限度地保持其天然活性与完整性。

⦁ 原料预处理与初提： 纯化始于精心筛选的生物原料。根据目标蛋白的亚细胞定位（如胞浆、膜结合、胞核或分泌），采用相应的机械破碎、温和去垢剂（用于膜蛋白提取）或梯度离心等方法，制备出粗提物。此阶段的关键是维持适宜的pH、离子强度、低温环境并添加蛋白酶抑制剂，以保护目标蛋白免受降解。

⦁ 粗分离与浓缩： 利用目标蛋白与杂质在溶解度、电荷、大小等方面的差异进行初步富集。经典方法如硫酸铵沉淀或等电点沉淀，能有效浓缩蛋白并去除大量杂质。现代技术则更多采用超滤离心，快速实现脱盐、换液和浓缩，为下游精纯步骤做准备。

⦁ 层析技术精纯：这是获得高纯度产品的核心环节，通常采用多种层析技术串联。

离子交换层析（IEX）：根据蛋白质表面净电荷的差异进行分离。对于蛋白质纯化流程中电荷性质明确的目标物，IEX是高效且载量高的选择。

⦁ 疏水相互作用层析（HIC）：依据蛋白质表面疏水性的不同进行分离，特别适用于在较高盐浓度下仍保持稳定的蛋白，常与IEX互补使用。

⦁ 凝胶过滤层析（SEC）：又称尺寸排阻层析，依据蛋白质流体力学半径（大小）进行分离。它是评估蛋白天然状态（单体、寡聚体）、去除聚集体以及进行缓冲液置换的最终步骤，对于获得均一性的高纯度蛋白至关重要。

⦁ 亲和层析：这是最具特异性和高效率的纯化手段。利用目标蛋白与固定化配体（如抗体、底物、辅因子、金属离子或标签）的特异性可逆结合进行捕获。对于天然蛋白，常使用免疫亲和层析（如用单克隆抗体）或凝集素亲和层析（用于纯化糖蛋白）。尽管本文不涉及重组蛋白，但值得一提的是，His标签蛋白纯化是重组蛋白领域最主流的亲和层析策略。

⦁ 复性与后处理：对于某些在提取过程中可能失活或沉淀的蛋白，可能需要经过精细的复性步骤以恢复其天然构象与活性。最终纯化后的蛋白需经过严格的质量控制，包括SDS-PAGE、Western Blot、液相色谱、质谱以及活性检测（如ELISA或酶活测定），以确保其纯度、一致性及功能性。分装后，在优化的稳定剂存在下，于-80°C或液氮中长期保存。

▌天然蛋白产品的关键质量控制与应用

为满足科研应用需求，纯化后的天然蛋白产品需通过一系列严谨的质检。除了上述提及的纯度分析和活性验证，还需进行内毒素水平检测（尤其用于细胞实验）、浓度精确测定以及批次间一致性的评估。这些高度标准化的天然蛋白试剂，被广泛应用于免疫检测开发（如标准品、包被抗原）、生化试剂配制（如酶反应研究）、细胞培养添加剂、蛋白质组学研究中的标杆物，以及作为生产次级抗体或进行结构生物学研究的起始材料。

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参考文献

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2.Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 2003, 60, 523-533. 

3.Kumar, A., Prasad, A. & Sedlářová, M. Challenges and strategies for the purification of membrane proteins: a review. Prep Biochem Biotechnol 2023, 53(5), 463-474.